На протяжении нескольких месяцев благотворительный фонд «Жизнь как чудо» совместно с командой студентов и сотрудников МГУ им. М. В. Ломоносова, Ярославского государственного медицинского университета и Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН проводил научные исследования по разработке отечественного портативного анализатора (аммониметра), который необходим для оперативного определения уровня аммиака в организме и предупреждения развития гипераммониемии.

Гипераммониемия – это патологическое состояние, характеризующееся повышенным содержанием свободных ионов аммония в крови, приводящее к тяжелым неврологическим расстройствам. Даже незначительные отклонения от нормы могут оказать токсическое воздействие на организм и, в первую очередь, на центральную нервную систему – в особенности на головной мозг. Хроническая гипераммониемия приводит к задержкам в развитии и умственной отсталости. В тяжелых случаях наблюдаются судороги и кома. Единственный способ предупреждения развития этого состояния – быстрая и эффективная диагностика.

Гипераммониемия: причины и последствия для здоровья

Аммиак — конечный продукт обмена азотсодержащих соединений в организме человека. Печень, как орган с высоким обменом аминокислот и биогенных аминов, является одним из наиболее активных «производителей» аммиака. Являясь токсичным соединением, аммиак находится в крови в относительно небольших концентрациях – 11,0-32,0 мкмоль/л, а предельно допустимый уровень у взрослого человека – 60 мкмоль/л. Симптомы аммиачного отравления проявляются при превышении этих пределов в 2-3 раза.

Причины повышения концентрации аммиака различны: они могут быть обусловлены либо наследственной патологией (наследственными болезнями обмена), либо другими состояниями, которые могут сопровождаться транзиторным повышением аммиака (приобретенная форма). Приобретенная форма имеет внепеченочное происхождение: повышение уровня аммиака в крови происходит, например, при кровотечении из отделов желудочно-кишечного тракта, сердечной недостаточности или эндокринных нарушениях.

Независимо от причины, гипераммониемия при отсутствии своевременного лечения приводит к необратимым изменениям клеток головного мозга и других органов. В связи с этим требуются методы оперативного количественного определения аммиака в крови. К прямым методам относят ионометрический, спектрофотометрический, ферментативный, а также УЗИ печени и генетические исследования.

Зачем нужны аммониметры

Большинство методов точного определения уровня аммиака (через забор образца крови) достаточно трудоемки, поскольку необходимо соблюдать технику забора крови и режим охлаждения до проведения анализа. Измерение должно проводиться в максимально короткие сроки, поскольку концентрация аммиака увеличивается пропорционально периоду хранения образца.

Оптимальным для определения аммиака является экспресс-тест, основанный на фотометрическом измерении интенсивности окраски тест-полоски с красителем после нанесения на нее венозной крови. Для проведения этого экспресс-метода необходимы аммониметры – специальные портативные приборы. Для данного анализа разработан японский анализатор PocketChem BA (Япония), не имеющий аналогов. Он позволяет определить уровень аммиака в цельной крови методом микродиффузии. Ионы аммиака из образца крови при нанесении на индикаторную полоску, пропитанную солью борной кислоты, переходят в газообразное состояние и, попадая на индикатор (бромкрезоловый зеленый), изменяют его цвет. Степень изменения цвета пропорциональна концентрации образовавшегося аммиака (диапазон измерения — 8-285 мкмоль/л, время выполнения теста — 180 с.). Аппарат имеет минимальные размеры (умещается на ладони взрослого человека) и прост в использовании.

Однако во избежание проблем с поставкой японского аммониметра и острой нехватки прибора в России необходимо развивать отечественное производство и централизованную систему сбора данных по гипераммониемии у детей и взрослых – что и является главной целью совместного проекта фонда «Жизнь как чудо» и научной группы МГУ им. М. В. Ломоносова.

Ход исследования

Молодые ученые на протяжении нескольких месяцев проводили исследования и анализ солей аммония (NH₄Cl, C₆H₁₇N₃O) на спектрофотометре «СФ-2000» отечественного производства. Для приготовления растворов команда использовала несколько реактивов: фенолфталеин, ализариновый желтый-Р и бромкрезоловый зеленый (используется в японском приборе).

На первом этапе была определена оптическая плотность в растворах аммония разной концентрации без индикаторов, а далее уже получены спектрофотограммы растворов трех индикаторов. Следующий этап состоял в получении спектрофотограмм растворов аммония с добавлением индикаторов: был выбран диапазон концентраций аммония в растворе от 10 до 200 мкмоль/л, отвечающий различным степеням тяжести гипераммониемии у человека.

«Оптимальным индикатором действительно можно считать фенолфталеин. Он широко распространен, стоит дешево, и полученные с его помощью результаты на текущем этапе исследования являются достаточно точными. Тем не менее, бромкрезоловый зеленый, который используется в оригинальном японском аммониметре, обладает большей чувствительностью. Его можно рассматривать в качестве основы для приборов с повышенной точностью измерений», – добавляет Федор Касьянов, один из членов научной группы, студент 3-го курса химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Таким образом, на текущем этапе команда разработала методику определения аммония спектрофотометрическим методом в водных растворах с использованием фенолфталеина и бромкрезолового зеленого. Также в процессе создания прототипы тест-полосок на основе этих двух индикаторов.

Федор Касьянов. Из личного архива

На следующем этапе проекта научная группа планирует применить методику определения аммония для анализа аммиака в изотоническом растворе крови, а затем сравнить эффективность тест-полосок с использованием двух индикаторов с учетом данных по измерению аммиака в изотоническом растворе.

«Одной из заключительных стадий проекта будет разработка прототипа отечественного прибора, – говорит Лариса Фишгойт. – Для этого необходимо провести обработку всех полученных статистических данных, определить погрешности и, наконец, осуществить выбор оптимальных условий работы прибора».

Важность аммониметра для пациентов с гипераммониемией

При гипераммониемии отравление организма происходит буквально в течение нескольких часов. При отсутствии должного лечения есть существенный риск летального исхода развития болезни.

«В случае с гипераммониемией время может идти даже не на дни, а на часы, поэтому определить повышенный аммиак необходимо как можно раньше», – поясняет Борис Лошкарев.

С января 2021 года фонд «Жизнь как чудо» запустил проект «Гипераммониемия» и стал активно закупать аммониметры из Японии для медицинских учреждений в различных регионах России для измерения уровня аммиака в крови. Также в рамках проекта ведущие специалисты профильных медицинских центров проводят курс обучающих лекций, тренингов и телемедицинских консультаций по диагностике заболеваний, ассоциированных с гипераммониемией, и тактике ведения пациентов с данной патологией.

Фото Ларисы Фишгойт. Из личного архива

«При наличии прибора в роддоме или больнице можно за несколько минут определить уровень аммиака в крови, что позволит начать своевременное специфическое лечение гипераммониемии и предотвратить тяжелые последствия. Я верю, что в будущем все усилия окупятся улыбками детей, которых спасли вовремя благодаря этому проекту, а наши ученые смогут создать отечественный аналог аппарата», – говорит Анастасия Черепанова, директор благотворительного фонда «Жизнь как чудо».

Состав научной группы:

Лариса Фишгойт, кандидат химических наук, старший научный сотрудник химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова,

Борис Лошкарев, студент 5-го курса факультета «Лечебное дело» Ярославского государственного медицинского университета,

Федор Касьянов, студент 3-го курса химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова,

Егор Перковский, студент 3-го курса химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова,

Андрей Князев, аспирант химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова,

Владимир Кокорекин, кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН.